20世纪初到二战结束,研制和使用的生物战剂主要是细菌,当时称为“细菌武器”。开始时的战剂仅限于少数几种细菌,如炭疽杆菌、马鼻疽杆菌和鼠疫杆菌等。生产规模很小,施放方法主要是由特工人员潜入敌方,用装在小瓶中的细菌培养物秘密污染水源、食物或饲料。
从30年代开始,研制生物武器的国家增多,主要有日本、德国、美国、英国等。生物战剂种类增多,生产规模扩大,施放方式改为用飞机施放带菌媒介物,包括带菌的跳蚤、虱子、老鼠、羽毛甚至食品,攻击范围扩大。
臭名昭著的731部队就是二战时期日本在中国建立的生物武器研制机构之一,日军使用细菌武器杀害了大量中国军民。德国主要研究鼠疫杆菌、霍乱弧菌、斑疹伤寒立克次体和黄热病毒等战剂和细菌悬气机喷洒装置。
美国于1941年成立生物战委员会,进行空气生物学实验研究。英国于1940年建立生物武器研究室,曾在格瑞纳德岛上用小型航弹和炮弹施放炭疽胞菌。加拿大也研究过肉毒毒素的大规模生产方法,并用飞机进行过喷洒试验。